پلاسمید و انواع آن
Plasmide
مقدمه

ژنوم باکتریها از دو قسمت تشکیل شده است؛ ژنوفور و پلاسمید. گاهی به ژنوفور، کروموزوم گفته میشود ولی نام درست آن ژنوفور است.
سالها است تصور می شود که ژنوم باکتریها فقط از یک کروموزوم حلقوی، متشکل از DNA دو رشته ای (ds DNA) و در مواردی یک یا چند پلاسمید(ds DNA)حلقوی تشکیل شده است .اما آیا واقعا این پندار درست است ؟ امروزه باکتریهای زیادی کشف شده اند که از این قانون پیروی نمیکنند.تعداد زیادی از باکتریها دارای چند کروموزوم مختلف اند(n کروموزومی)تعدادی از باکتریها نیز دارای دو کروموزوم مشابه میباشند (دیپلوئیدیا 2n کروموزومی). همچنین برخی از باکتریها دارای کروموزومهای خطی هستند.شناسایی این باکتریها ، بسیاری از تصورات میکروبیولوژیستها در مورد مکانیسمهای مختلف همانند سازی ، رونویسی ، جداشدن کروموزومهااز هم(Segregation) ،کراسینگ آور و وجود هموزیگوسیتی و هتروزیگوسیتی کامل در باکتریها را دگرگون ساخت وبا شناسایی رشته هایی همانند دوک تقسیم میتوز بوسیله میکروسکوپ الکترونی در برخی از باکتریها، فرضیه وقوع میتوز در باکتریها بوسیله برخی از باکترولوژیستهای مولکولی ارائه شد.
پلاسمید
طرح کلی یک [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] با پلاسمید در درون آن. ۱- دی‌ان‌ای کروموزومی ۲- پلاسمیدها.
پلاسمید را می‌توان قسمتی از ماده ژنتیکی یا [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] یک جاندار دانست که مستقل از [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] عمل می‌نماید.
پلاسمیدها در [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ]، [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] و [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] بطور طبیعی دیده می‌شوند ولی می‌توان آنها را به شکل مصنوعی وارد [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] جانوری نیز نمود.
پلاسمیدها معمولا به شکل یک مولکول [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] دورشته‌ای حلقوی هستند (هرچند انواع خطی پلاسمید نیز وجود دارد). [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] پلاسمیدها در [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] و بطورمستقل از [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] انجام می‌گیرد. هرپلاسمید دارای یک محل آغاز همانند سازی (ori) است که همانند سازی پلاسمید از آن نقطه شروع می‌شود.
تفاوت پلاسمید با کروموزوم
پلاسمیدها عناصر ژنتیکی هستند که چندان ضرورتی برای سلول ندارند و تنها برخی ویژگی‌ها را به باکتری‌ها می‌دهند که به بقای آنها کمک می‌کند و در صورتیکه پلاسمیدهای [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] حذف شوند ،[فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] می‌تواند به زندگی خود ادامه دهد. همچنین [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] پلاسمیدها ارتباطی با [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] و [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] ندارد و پلاسمیدها می‌توانند مستقل از [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] به تعداد نامحدود (تعداد را نیاز سلول و شرایط محیطی تعیین می‌کند) تکثیر شوند. در هر سلول ممکن است چندین پلاسمید مشابه وجود داشته باشد. در صورتیکه کروموزوم‌ها بسیار برای [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] حیاتی هستند و درصورت حذف هر یک ازکروموزوم‌ها، [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] خواهد مرد. تعداد دقیق کروموزوم‌ها بسیار برای تعادل ژنتیکی [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] ضروری است حتی اگر یکی از کروموزوم‌های همولوگ حذف شوند این تعادل بهم خواهد خورد. همانند سازی کروموزوم‌ها دقیقاً منطبق با [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] است و در هر چرخه سلولی فقط یک با ر همانند سازی می‌کنند.
پلاسمیدها چه تفاوتی با کروموزومهای باکتری دارند
از آنجا که از سالها پیش مشخص شده بودکه در برخی از باکتریها پلاسمیدهای مختلفی وجود دارد و اکثرا این پلاسمیدها بصورت پلی پلوئید میباشند، برای عده ای از باکتیولوژیستها این شبهه پیش آمد که شاید کروموزومهای چند گانه ویا کروموزومهای دیپلوئید در باکتریها ، در واقع پلاسمیدهای بسیار بزرگی باشند که بعلت اندازه آنها با کروموزوم باکتری اشتباه شده اند.اما هنگامی که تعریف دقیق کروموزوم و پلاسمید وتفاوتهای آنها توسط عده دیگری از دانشمندان ارائه شد ، این شبهه نیز مرتفع شد.. پلاسمیدها عناصر ژنتیکی هستند که چندان ضرورتی برای باکتری ندارند و تنها برخی خصوصیات ویژه را به باکتریها می دهند که به بقاء آنها کمک می کند،و در صورتیکه پلاسمیدهای باکتری حذف شوند ، باکتری میتواند به حیات خود ادامه دهد. همچنین همانند سازی پلاسمید ها ارتباطی با چرخه سلولی و تقسیم باکتری ندارد و پلاسمیدها میتوانند مستقل از سیکل سلولی به تعداد نامشخص(تعداد را نیاز سلول و شرایط محیطی تعیین میکند) تکثیر شوند.در هر سلول ممکن است چندین پلاسمید مشابه وجود داشته باشد. در صورتیکه کروموزومها بسیار برای باکتریها حیاتی هستند و درصورت حذف هر یک ازکروموزومها، باکتری خواهد مرد. تعداد دقیق کروموزومها بسیار برای تعادل ژنتیکی باکتری ضروری است حتی اگر یکی از کروموزومهای همولوگ در باکتریهای دیپلوئید حذف شوند باکتری خواهد مرد. همانند سازی کروموزومها دقیقاً منطبق با چرخه سلولی است و در هر سیکل سلولی فقط یک با ر همانند سازی میکنند. بنابراین تفاوت پلاسمیدها با کروموزومها در اندازه آنها نیست امروزه پلاسمیدها یی شناسایی شده اند که می توانند از کروموزومها بسیار بزرگتر باشند(kbp 500-2500). این پلاسمیدها که مگاپلاسمید نام دارند، در جنسهای: Agrobacterium, Paracoccus, Pseudomonas, Alcaligenes, Rhizobium, Thermus دیده شده است.
پلاسمید در [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ]
این پلاسمیدها به صورت آزاد در مخمر وجود دارند. یکی از انواع طبیعی پلاسمیدهای مخمر، پلاسمید ۲ میکرونی، نامدیده می‌شود که از جمله از پلاسمیدهای حلقوی مخمر می‌باشد. این پلاسمید مخمری در حدود ۶۳۰۰ جفت باز دارد که تعداد کپی آن به ۵۰ کپی در [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] (فضای درونی هسته) می‌رسد. تقسیم این پلاسمیدها وابسته به کروموزوم مخمر نمی‌باشد و احتمالا پروتئینهای لازم برای همانند سازی را خود کد می‌کنند. گروه دیگری از پلاسمیدهای حلقوی مخمر پلاسمیدهای اپیزومی مخمر نامیده می‌شوند.
پلاسمید در گیاهان
پلاسمید در سلول‌های گیاهی در اثر عفونت با باکتری [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] وارد می‌شود. امروزه از اینگونه پلاسمیدها، پس از انجام تغییراتی بر روی آنها، برای انجام [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] در گیاهان، استفاده می‌شود.
پلاسمید در باکتری
بیشتر [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] دارای پلاسمیدهایی می‌باشند که به آنها ویژگی‌های تازه‌ای مانند مقاومت به یک [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] خاص، مصرف نوعی قند یا [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ]، تولید رنگدانه، بیماریزایی، تجزیه هدروکربن‌ها یا مولکول‌های پیچیده شیمیایی و ... می‌دهد.
یک ویژگی برجسته [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ]، توانایی آنها در تبادل بسته‌های کوچک اطلاعات ژنتیکی است . این اطلاعات به صورت پلاسمیدها منتقل شوند. در بعضی موارد، پلاسمیدها ممکن است از یک سلول به سلول دیگری منتقل شده و بنابراین مجموعه‌ای از اطلاعات ژنتیکی تخصص یافته را درون یک جمعیت انتقال دهند. بعضی پلاسمیدها میزبان‌های زیادی دارند که آنها را قادر می‌سازد مجموعه‌ای از ژن‌ها را به باکتری‌های مختلف منتقل کنند. در باکتری، پلاسمیدها می‌توانند از یک باکتری به باکتری دیگر منتقل شوند و به همراه این انتقال ویژگی‌های باکتری نیز منتقل می‌شود. مثلا یک باکتری که مقاوم به [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] نبوده در اثر دریافت یک پلاسمید که [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] مقاومت به پنی سیلین را داراست، به این [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] مقاوم می‌شود یا یک باکتری که بیماریزا نبوده، در اثر دریافت یک پلاسمید، بیماریزا می‌شود.
پلاسمیدها خطی
پلاسمیدهای خطی سالها پیش از کروموزومهای خطی در سال 1979 در باکتری Streptomyces rochei کشف شد. در آن هنگام در این باکتری خصوصیاتی مشاهده شد، که با توجه به توارث آنها، ژنهای عامل آن صفات می بایست بر روی پلاسمید قرار می گرفتند. اما بکمک روشهای عادی جداسازی پلاسمید ، در باکتری هیچ پلاسمیدی مشاهده نشد. پس جستجوهای متعدد سرانجام دانشمندان توانستند بوسیله روش PFGE (ژل- الکتروفورز با میدان الکتریکی متناوب)از باکتری پلاسمیدهایی را جداسازی کنند. اما باکمال تعجب ، با استفاده از روشهایی مانند نقشه برداری فیزیکی (با اثر دادن اندوکلئازهای محدود کننده بر روی پلاسمیدها)، الکتروفورز به روش SSCP(single -standrd conformationol poly mophism) و میکروسکوپ الکترونی مشخص شد که این پلاسمیدها، خطی هستند.این نوع پلاسمیدها همچنین دربرخی از جنسهای خانوادهای آکتینومیستالها (همانندRhodococcus opacus)استریتومایسس ها (مانند S.laurentli, S.roche, S.lasalensis, S.coelicor, S.Lividans) ومایکوباکتریهایی مانند M.avium, M.brander, M.telomeric دیده شده است.
پلاسمید در مهندسی ژنتیک
با تغییراتی که در توالی پلاسمیدها ایجاد می‌کنند ویژگی‌هایی در آنها بوجود می‌آید که در [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] استفاده می‌شوند. معمولا به پلاسمیدهایی تغییر یافته ژنتیکی [فقط کاربر هاي عضو شده مي توانند لينک ها را ببينند ] می‌گویند.
انتقال ژن به گیاه به واسطه آگروباکتریوم
در تعدادی از کشورهای پیشرفته، سطح وسیعی از مزارع گیاهان مهم اقتصادی مثل ذرت، سویا، کلزا، پنبه، سیب­زمینی و گوجه فرنگی به گیاهان تراریخته اختصاص یافته است و روند رو به رشدی در تولید این گیاهان تراریخته با استفاده از آگروباکتریوم، در مقایسه با بمباران ذره­ای دیده می­شود. اما هنوز چالش­های متعدد مستقل از ژنوتیپ در انتقال ژن به بسیاری از گونه­های مهم زارعی و همچنین گونه­های جنگلی مورد استفاده در صنایع چوب و کاغذ وجود دارد. به علاوه، ابراز پایدار و قابل پیش­بینی ژن­های تراریخته کماکان غامض و پیچیده می­باشد. تاکنون در چندین مقاله مروری عالی، جنبه­های مختلف زیست­شناختی آگروباکتریوم، با جزییات شرح داده­ شده است.
در این مقاله، نویسنده توضیح می­دهد که چگونه دانشمندان با استفاده از دانش پایه زیست­شناسی آگروباکتریوم، این باکتری را به عنوان ابزاری در مهندسی ژنتیک گیاهی توسعه می­دهند. نویسنده همچنین در جستجوی این موضوع است که چگونه درک رو به گسترش ما از زیست­شناسی آگروباکتریوم به ما در توسعه کاربرد انتقال ژن به واسطه این باکتری کمک می­کند. وی عقیده دارد که بهبود فناوری انتقال ژن نیاز مبرمی به دست­ورزی این فرآیندهای بنیادی زیست­شناختی خواهد داشت.
طبقه‌بندی جنس آگروباکتريوم و طيف ميزبانی
جنس آگروباکتریوم به تعدادی گونه تقسیم می­شود. این تقسیم­بندی عمدتاً بر اساس علائم حاصل از بیماری و طیف میزبان می­باشد. بنابراین، A. radiobacterیک گونه غیر بیماری­زا است، A. tumefaciensعامل بیماری گال تاجی، A. rhizogenes عامل بیماری ریشه مویی و A. rubi عامل بیماری گال نیشکر می­باشد. به تازگی یک گونه جدید به نام A. vitis که عامل ایجاد گال در انگور و تعداد دیگری گیاه است، نیز پیشنهاد شده است. گرچه Bergey's Manual of Systematic Bacteriology هنوز این نام­گذاری را منعکس می­نماید ولی این طبقه­بندی پیچیده و گیج­کننده است. ما می­دانیم که در اکثر موارد، علائم بیماری یاد شده حاصل از نوع پلاسمید مولد تومور است که در درون سویه خاصی وجود دارد. از دست دادن پلاسمید مولد تومور یا جایگزینی آن با پلاسمید دیگر، می­تواند باعث تغییر علائم بیماری شود. به عنوان مثال، آلودگی گیاهان با A. tumefaciens C58 که دارای پلاسمید pTiC58 از دسته پلاسمیدهای نوپالین می­باشد، باعث ایجاد گال تاجی جنینی می­شود. اگر این پلاسمید حذف شود، این سویه باکتری غیر بیماری­زا می­شود. وارد کردن پلاسمید Ri به این سویه که پلاسمید خود را از دست داده است، باعث تبدیل باکتری به سویه A. rhizogenesمی شود. به علاوه، با وارد کردن پلاسمید Ti (القا کننده تومور) از A. tumefaciens به A. rhizogenes، سویه ایجاد شده تومورهایی با ظاهری تغییریافته در گیاه Kalanchoeایجاد می­کند.بنابراین، چون A. tumefaciens می­تواند به راحتی با جانشینی یک نوع پلاسمید سرطان­زا با پلاسمید دیگر، به A. rhizogenesتبدیل شود، واژه گونه معنی خود را از دست می­دهد. شاید یک سیستم طبقه­بندی با معنی­تر، جنس آگروباکتریوم را بر اساس خصوصیات متبولیکی و رشد به biovar هایی تقسیم نماید. با استفاده از این سیستم، اکثر سویه­های A. tumefaciens و A. rubiبه biovar اول تعلق داشته، سویه­های A. rhizogenes biovar دوم را تشکیل داده و biovar سوم نماینده سویه­های A. vitisمی­باشد. سیستم دیگری نیز برای طبقه­بندی جنس آگروباکتریوم پیشنهاد شده است. تکمیل توالی­یابی DNA کل ژنوم A. tumefaciens C58 که مرکب از یک کروموزوم خطی، یک کروموزوم حلقوی، یک پلاسمید Ti و یک پلاسمید بزرگ دیگر می­باشد، ممکن است نقطه شروعی برای طبقه­بندی مجدد سویه­های Agrobacteriumدر گونه­های واقعی گردد. علی­رغم سرگردانی موجود در طبقه­بندی گونه­ها، شاید مهمترین موضوع در مهندسی ژنتیک گیاهان، طیف میزبانی سویه­های مختلف آگروباکتریوم ­باشد. به عنوان یک جنس، آگروباکتریوم می­تواند DNA را به تعداد قابل ملاحظه­ای از موجودات زنده شامل بسیاری از دولپه­ای­ها و تک­لپه­ای­ها در گونه­های نهان­دانه و بازدانگان منتقل نماید. به علاوه، آگروباکتریوم توانایی انتقال ژن به قارچ­هایی مثل مخمر، آسکومیست­ها و بازیدومیست­ها را دارد. در سال 2001 انتقال DNA به سلول انسانی توسط آگروباکتریوم گزارش شده است. اساس مولکولی و ژنتیکی طیف میزبان یک سویه آگروباکتریوم هنوز روشن نشده است. مطالعات اولیه حاکی از این است که پلاسمید Ti در مقایسه با ژن­های کرورموزومی، تعیین­کننده ژنتیکی اصلی طیف میزبانی می­باشد. نشان داده شده است که چندین مکان ژنی بیماری­زایی (vir) بر روی پلاسمید Ti ازجمله virCو virF، در تعیین گونه­های گیاهی که انتقال ژن به آنها می­تواند صورت گیرد تا تومورهای گال تاجی ایجاد شود، نقش دارند. مشخص شده که مکان ژنی virH که قبلاً pinF نامیده می­شد، در توانایی آگروباکتریوم در انتقال ژن به ذرت موثر می­باشند. سایر ژن­های vir مثل virGنیز در بیماری­زایی بیش از حد برخی سویه­های خاص مشارکت دارند.
به هرحال اکنون روشن شده است که طیف میزبانی فرآیند بسیار پیچیده­ای می­باشد که تحت کنترل ژنتیکی چندی عامل در باکتری و میزبان گیاهی می­باشد. نتیجه هر تلاش و تحقیقی برای انتقال ژن به گیاهان مختلف، خصوصاً گیاهان جدید، اطلاعاتی درباره طیف میزبانی آگروباکتریوم به ما می­دهد. به طور مثال، امروزه انتقال ژن به بسیاری از گونه­های گیاهان تک­لپه مثل ذرت، برنج، جو و گندم توسط بسیاری از سویه­های آگروباکتریوم ممکن شده و و فنوتیپ مقاومت به علف­کش و آنتی­بیوتیک در آنها ایجاد شده است اما تومور گال تاجی در این گونه­های گیاهی رشد نمی­کند. شاید طیف میزبانی حاصل برهمکنش پلاسمید Ti خاصی با زمینه کروموزومی باکتریایی مشخصی باشد. به طور مثال، پلاسمید pTiBo542 در سویه طبیعی خود یعنی A. tumefaciens Bo542 قابلیت تومورزایی محدودی بر روی گونه­های متعدد بقولات دارد. این پلاسمید اگر در زمینه کروموزومی A. tumefaciens C58 قرار گیرد، باعث بیماری­زایی قوی در سویا و سایر بقولات می­شود. سرانجام، حساسیت به بیماری گال تاجی، یک اساس ژنتیکی در کدوییان، نخود، سویا، انگور و حتی اکوتیپ­های مختلف Arabidopsis thalianaدارد. نقش ژن­های بیماری­زایی باکتری و ژن­های میزبان در فرآیند انتقال ژن و راه­های دست­ورزی آنها برای مقاصد مهندسی ژنتیک، در ادامه شرح داده خواهد شد.